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Los fundamentos y la historia de la fluorescencia

y los puntos cuánticos.

En algún momento de su carrera de investigación y ciencia, sin duda se encontrará con el microscopio de fluorescencia. Esta técnica omnipresente ha transformado la forma en que los microscopistas pueden crear imágenes, marcar y rastrear cualquier cosa, desde organismos completos hasta proteínas individuales y más. En este artículo, examinaremos qué se entiende por “fluorescencia”, la historia y la física básica detrás de su definición, el descubrimiento y la aplicación de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) y un vistazo al campo de las sondas fluorescentes, que incluye Quantum Dots.

¿Cómo definimos “fluorescencia”?

Al escribir la frase “definición de fluorescencia” en cualquier motor de búsqueda, obtendrá la siguiente frase, o algo muy similar; “La emisión de radiación visible o invisible de ciertas sustancias como resultado de la radiación incidente de una longitud de onda más corta, como los rayos X o la luz ultravioleta”. ¿Cómo se relaciona esta definición con la microscopía de fluorescencia (Figura 1)? La “radiación incidente de una longitud de onda más corta” es simplemente la fuente de luz utilizada para “excitar” los fluoróforos en una muestra. Esta luz puede incluir el espectro visible, ultravioleta (UV) e infrarrojo (IR) y la fuente en un microscopio puede variar desde una lámpara de arco de mercurio o xenón hasta láseres. Los fluoróforos (“ciertas sustancias” en la definición anterior) son compuestos químicos que tienen propiedades especiales por las cuales pueden reemitir luz / fotones de longitud de onda mayor con la excitación por luz que tiene una longitud de onda inferior.


  • Células marcadas, fluorescentemente visualizadas mediante microscopía de fluorescencia.


La unidad básica de longitud de onda es el medidor y la “longitud de onda” se define como la distancia entre dos picos o valles sucesivos de una onda de luz. El símbolo para la longitud de onda es la letra griega lambda (l). Las longitudes de onda que se usan típicamente en microscopía están en el rango de nanómetros (nm) dentro del espectro visible entre 400 y 700 nm, el espectro de UV por debajo de 400 nm y el espectro de IR que comienza en 700 nm.

Los fluoróforos se clasifican por su longitud de onda de excitación y emisión, que generalmente se presenta en forma de un gráfico que muestra los picos máximos. Los fluoróforos son naturalmente estables en lo que se denomina el “estado fundamental”. Cuando absorben un fotón de luz (de la luz de “longitud de onda más corta”), la energía del fotón eleva los electrones del fluoróforo a un estado de “excitación” de energía superior. Los electrones excitados no permanecen en este estado, pero pierden la energía vibratoria y emiten un fotón de una longitud de onda más larga en su retorno al estado fundamental. Para los fluoróforos usados ​​en microscopía, un ciclo completo desde la excitación hasta el retorno a tierra toma en la región de 0.5 a 20 nanosegundos. Las longitudes de onda de excitación y emisión de fluoróforos se abrevian comúnmente como la letra griega lambda con un subíndice “ex” (excitación) o “em” (emisión; lex o lem). Cada fluoróforo tiene un espectro de excitación y emisión máximo distinto y esta propiedad se usa para distinguir diferentes objetivos en el mismo espécimen de interés

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